Массовые акции протеста, организованные народными фронтами в Эстонии и Латвии, а также движением «Саюдис» в Литве, сначала поддерживали демократические инициативы перестройки, но со временем переключились на явные призывы к независимости от Советского Союза. 23 августа 1989 года, более двух миллионов человек создали человеческую цепь, соединив столицы всех трех балтийских стран, проявив тем самым стремление к выходу из состава СССР. В 1988-1989 годах, Верховные Советы этих стран проголосовали за декларации о независимости, что стало фактическим началом отсоединения от Советского Союза и дало старт "параду суверенитетов". Эти события стимулировали усиление сепаратистских тенденций в других советских республиках. 24 декабря 1989 года, 2-й Съезд народных депутатов СССР признал наличие "тайного протокола" к Риббентроп-Молотовскому пакту 1939 года, признав его нарушением ленинских принципов внешней политики СССР и вопросом юридической спорности в отношении суверенитета третьих стран, что усилило правовые основания для отделения балтийских государств и последующего выхода Молдавии из Советского Союза. В 1989-1990 годах, коммунистические партии Эстонии, Латвии и Литвы разделились на сторонников и противников независимости, причем первые составляли большинство.
В Украине также активно развивался процесс отделения, который получил оформление в сентябре 1989 года с созданием общественно-политической организации "Рух", выступавшей под знаменем национальной демократии. Эта идея завоевала особую популярность на западе республики, в то время как на юго-востоке и в Крыму она не нашла такой широкой поддержки. Генеральный секретарь Компартии Украины В. В. Щербицкий с 1972 по 1989 год пытался противостоять распространению националистических настроений. Чернобыльская катастрофа 1986 года и последующие попытки сокрыть её масштабы и риски со стороны руководства КПСС существенно подорвали доверие к партии как в самой республике, так и за её пределами. В ходе выборов в Верховный Совет Украинской ССР 1990 года большинство мест заняла коммунистическая «Группа 239», насчитывавшая 239 из 450 депутатов первого созыва. Эта группа выступала за увеличение автономии Украины в рамках обновленной союзной страны. Вторую крупную фракцию составили депутаты от «Руха», объединившиеся в «Народную Раду» с 125 мандатами, которые настаивали на выходе Украины из СССР. 16 июля 1990 года Верховный Совет Украины принял Декларацию о суверенитете страны, принципы которой должны были стать основой для нового союзного договора.
Аналогичные трансформации происходили в Белорусской ССР. В 1988 году была основана организация «Мартиролог Беларуси», занимавшаяся изучением сталинских репрессий на территории республики и оказавшая весомое влияние на настроения в обществе. На её базе был создан Белорусский народный фронт (БНФ), действовавший в интересах возрождения белорусской культурной самобытности, продвижения демократии и суверенитета. Консервативное руководство Белорусской ССР пыталось сопротивляться инициативам БНФ. События вокруг Чернобыльской аварии и последующей реакции властей серьезно подорвали доверие к КПСС. В 1989 году в Минске были организованы масштабные митинги, осуждающие утаивание данных о последствиях аварии и числе жертв. Одной из крупнейших акций стала демонстрация 30 сентября под названием «Чернобыльский путь», насчитывавшая около 30 тысяч участников, инициированная БНФ и жестоко подавленная силами порядка. Эти события обострили противостояние между властью, ужесточавшей административные меры в политической сфере, и оппозицией, пользующейся поддержкой белорусской интеллигенции. В ходе предвыборной кампании к выборам Съезда народных депутатов СССР 1989 года БНФ смог мобилизовать десятки тысяч сторонников, несмотря на давление со стороны органов правопорядка. Из 50 депутатов, избранных от Белорусской ССР, большинство были представителями государственно-партийной номенклатуры, но активная кампания БНФ способствовала поражению некоторых известных деятелей номенклатуры. Оппозиция оказала значительное давление, что привело к событиям 26 января 1990 года. Законодательный орган Белорусской ССР одиннадцатого созыва утвердил законодательный акт о статусе языков, согласно которому белорусский язык получил статус официального. В ходе выборов в Верховный Совет двенадцатого созыва, состоявшихся 4 марта 1990 года, доминировали представители Коммунистической партии, занявшие 289 из 328 мест, в то время как представители БНФ получили лишь 28 мест. Позже, 27 июля, была принята Декларация о суверенитете Республики Беларусь, предусматривающая разработку договора о создании союза независимых социалистических государств.
В столице Молдавии, Кишиневе, в 1988 году прошли акции протеста с националистической направленностью, а в течение 1988-1989 годов появилось несколько организаций, выступавших против советской власти и российского влияния. Одной из них стал Народный фронт Молдовы (1989), который выступал за политическую независимость республики, признание румынского языка на латинской основе официальным, а также за возможное объединение с Румынией. Это вызвало раздражение среди русскоговорящих жителей, особенно в Приднестровье. В 1990 году здесь была провозглашена Приднестровская МССР, не признанная центральными властями, что заложило основу для военного конфликта. В мае 1991 года Молдавская ССР была переименована в Республику Молдова, а 27 августа ее парламент провозгласил независимость страны.
В регионе Закавказья происходили острые этнические столкновения, связанные с вопросами суверенитета республик и автономий. Демократические преобразования перестройки позволили радикально настроенным гражданам самоорганизоваться по этническим признакам, что ускользнуло от контроля КПСС и правоохранительных органов. Первые секретари ЦК Коммунистических партий Армении, Азербайджана и Грузии старались сохранить территориальную целостность своих государств, ощущая давление националистических движений, и обращались к руководству КПСС за помощью в мирном разрешении этнических конфликтов. Центральные органы власти СССР безуспешно предпринимали попытки нормализовать обстановку в регионе, используя как дипломатические, так и силовые меры, чтобы поддержать статус-кво государственных границ республик и удержать их в составе союза. В период 1987–1988 годов конфликт между армянами и азербайджанцами в Нагорном Карабахе перешёл в новую стадию на фоне возросшей активности национальных движений в Армянской и Азербайджанской ССР. В этих республиках происходили массовые акты насильственного изгнания населения и беспорядки, среди которых наибольшую известность приобрели события в Сумгаите в 1988 году и антиармянские погромы в Баку, которые привели к трагическим январским событиям 1990 года. Суровое подавление волнений, инициированных Народным фронтом Азербайджана, советскими войсками в Баку привело к многочисленным жертвам среди мирного населения, что усилило сепаратистские настроения в республике, как среди обычных граждан, так и среди политической элиты. Осенью 1990 года на выборах Верховного Совета Азербайджанской ССР Коммунистическая партия Азербайджана завоевала подавляющее большинство мест (77,8%), тогда как Народный фронт Азербайджана получил 12,5% мандатов. Несмотря на это, Народный фронт обладал значительной народной поддержкой и контролировал собственные вооружённые формирования, что позволяло ему оказывать весомое влияние на политический курс в республике.
В Армянской ССР споры вокруг Нагорного Карабаха также играли ключевую роль в процессе перестройки. Возникшее в результате мощное национальное движение армян выступало за переход контроля над Нагорно-Карабахской автономной областью к Армянской ССР. В августе 1987 года Центральному Комитету КПСС была передана петиция с более чем 70 тысячами подписей, требующая передачи Нагорного Карабаха Армении, а уже в октябре в Ереване начались митинги с аналогичными требованиями. Первый секретарь ЦК Коммунистической партии Армении К. С. Демирчян пытался урегулировать карабахский вопрос на политическом уровне, обратившись в феврале 1988 года в ЦК КПСС с просьбой о создании специальной комиссии для рассмотрения вопроса самоопределения Нагорного Карабаха. Однако центральное руководство настаивало на неизменности границ между республиками в рамках СССР и не одобрило данное предложение. Верховный Совет Армянской ССР неоднократно высказывался за присоединение Карабаха к Армении, тогда как Верховный Совет Азербайджанской ССР стойко поддерживал его принадлежность к Азербайджану. Попытки ЦК КПСС разрешить конфликт не увенчались успехом, что способствовало усилению сепаратистских настроений в обеих республиках. В результате майских выборов 1990 года в Верховный Совет Армянской ССР большинство мест заняло оппозиционное к КПСС Армянское национальное движение. Спитакское землетрясение 7 декабря 1988 года, унёсшее более 25 тысяч жизней и разрушившее около 40% промышленности республики, также существенно повлияло на обстановку, вызвав серьёзные социально-гуманитарные проблемы.
В марте 1989 года грузино-абхазский конфликт обострился из-за массовых акций в Сухуми, требующих выхода Абхазской АССР из состава Грузинской ССР и превращения её в союзную республику. Осенью того же года Юго-Осетинская автономная область также заявила о стремлении к повышению своего статуса. Эти события подстегнули волну грузинского национализма, и 8–9 апреля в Тбилиси прошли массовые демонстрации за независимость, жестоко подавленные войсками, что привело к жертвам среди участников. Осенью 1990 года в ходе выборов в Верховный Совет Грузинской ССР победу одержал националистический блок «Круглый стол – Свободная Грузия», после чего его лидер З. К. Гамсахурдия был избран председателем Совета. В декабре Коммунистическая партия Грузии заявила о выходе из КПСС и признала важность достижения независимости республики. 9 апреля 1991 года Верховный Совет и Правительство Грузии приняли Акт о восстановлении независимости страны.
В начале периода перестройки межнациональные отношения в Центральноазиатских республиках были довольно напряжёнными. 17–18 декабря 1986 года в Алма-Ате произошли национальные выступления, вызванные решением М. С. Горбачёва заменить казаха Д. А. Кунаева на русского Г. В. Колбина на посту первого секретаря ЦК Коммунистической партии Казахстана. Репрессивное подавление протестов республиканскими и союзными военными структурами лишь усилило антироссийские и антисоветские чувства. Последующая волна преследований инициаторов беспорядков ещё больше разжигала эти настроения. Выбор Н. А. Назарбаева, ярого сторонника СССР, в качестве первого секретаря ЦК Компартии Казахстана в 1989 году и президента Казахской ССР в 1990 году, не смог сдержать желания республики к отделению. В Казахстане набирало обороты создание оппозиционных КПСС структур, многие из которых выступали за независимость. На парламентских выборах 25 марта 1990 года Коммунистическая партия Казахстана завоевала 95% мест. 25 октября принятие Декларации о суверенитете подтвердило приоритет местных законов над федеральными и возможность выхода из СССР, одновременно отмечая желание добровольно объединяться с другими республиками в Союз Суверенных Государств и использование декларации в качестве основы для нового союзного договора.
В Узбекской ССР крупным эпизодом перестройки стало так называемое "хлопковое дело", которое показало недостатки советской системы такие, как производственные фальсификации и всепроникающую коррупцию, особенно ярко проявившуюся в Центральноазиатских республиках. Антикоррупционная кампания усугубила отношения между центральной властью и местной партийно-хозяйственной элитой, приведя к отстранению многих чиновников от власти и к их арестам. В Узбекской ССР также росло этническое напряжение, что нашло отражение в Ферганских беспорядках 1989 года. И. А. Каримов, избранный в том же году первым секретарём ЦК Коммунистической партии Узбекистана, проводил более открытую политику в культурной и религиозной сферах по сравнению с предшественниками, одновременно укрепляя свою власть. В результате общественно-политические и религиозные организации в республике не имели такого влияния, как в других. Подобно Назарбаеву, Каримов сохранял умеренные взгляды и стремился к сохранению Узбекской ССР в составе обновлённого СССР, при этом добиваясь большей автономии для республики. В период Киргизской ССР наблюдалось нарастание межэтнических и социальных напряжений, что привело к стычкам между киргизами и узбеками в Оше в июне 1990 года с участием различных неформальных групп. Эти события стимулировали политическое объединение оппозиционных к Коммунистической партии сил в Киргизском демократическом движении в том же году, которое выступало в защиту суверенитета страны.
В Таджикской ССР исламский фундаментализм стал значительным элементом перестройки, а национально-демократическое движение активизировалось в стремлении к созданию секулярного и суверенного государства. Эскалация напряженности привела к беспорядкам в Душанбе в феврале 1990 года, катализатором которых стали слухи о распределении жилья армянским беженцам. Протесты также были направлены против руководства коммунистической партии и правительства республики. Ситуация обострилась до антирусских выступлений и была урегулирована силами милиции и армии. В свете растущей ксенофобии и ухудшения социально-экономических условий в конце 1980-х, из Центральной Азии начался масштабный исход этнических русских, которые представляли значимую часть населения и вносили вклад в развитие региона в различных сферах.